​Gila︱周民研究团队揭示了星形胶质细胞合胞体的发生成熟和功能检测方法

撰文︱钟时颖，周民

责编︱王思珍，方以一（勘误：标题中期刊名校改为Glia）

编辑︱王思珍

在大脑中，星形胶质细胞通过缝隙连接蛋白43和30形成细胞质连续的合胞体网络，对于合胞体内离子、代谢物和信号分子的扩散和平衡至关重要。但是，星形胶质细胞的发生开始于胚胎后期和出生后早期，而新生的星形胶质细胞并未形成合胞体[1]。目前，尚不清楚新生的星形胶质细胞在何时形成融合完全的合胞体。

此外，星形胶质细胞之间存在的强电耦合可以平衡单个细胞的膜电位，从而形成合胞体统一的电位，称为合胞体等电位[2]。有证据表明，合胞体等电位对于协调小胶质细胞-星形胶质细胞-神经元耦合，执行大脑正常功能具有重要作用[3]。等电位的丧失被证明与癫痫和抑郁症动物模型中病理改变有关[4]。因此，充分了解合胞体等电位的结构和功能对于探索星形胶质细胞生理和病理作用至关重要。

另一个问题是如何定义功能成熟的合胞体？星形胶质细胞重要功能之一是K⁺稳态调节。通过缝隙连接形成的合胞体以及成熟表达的细胞膜被动K⁺电导是确保星形胶质细胞进行K⁺调节的关键决定因素[5]。然而，新生星形胶质细胞缺乏这两个决定因素。那么从何时开始合胞体可以对K⁺稳态进行调节？探索一个可以对合胞体内K⁺缓冲效率进行定量测定的方法，对研究星形胶质细胞网络在神经系统疾病中的病理作用具有深远的价值。

为了回答这些基本问题，2023年1月4日，美国俄亥俄州立大学神经科学系周民教授研究团队在Glia上发表了题为“Genesis of a functional astrocyte syncytium in the developing mouse hippocampus“的研究论文，钟时颖、Conrad M. Kiyoshi和杜一星为论文共同第一作者，周民教授为论文通讯作者。研究跟踪了小鼠出生后海马CA1区辐射层中星形胶质细胞发育情况，并从细胞形态、合胞体结构、K⁺通道表达、合胞体等电位以及合胞体内K⁺调节能力等方面评估了星形胶质细胞的成熟过程。研究发现，在出生后（postnatal，P）第15 天（P15），单个星形胶质细胞的海绵状形态及空间组织达到稳定水平。在P11，星形胶质细胞从功能上开始具有成熟水平的被动K⁺电导。进一步，研究使用合胞体等电位来检测合胞体耦合及对K⁺空间调节能力的成熟。随着更多星形胶质细胞在发育过程中通过缝隙连接相互耦合形成合胞体网络以及K⁺电导的成熟，在P15，可以记录到被Na⁺电极溶液（[Na⁺]p）钳制的细胞具有近生理水平的合胞体等电位和被临近细胞完全补偿的外向K⁺电导。因此，在小鼠海马体CA1区中，星形胶质细胞合胞体在P15发育成熟，即单个合胞体在结构和功能上对合胞体内K⁺进行缓冲调节，保持K⁺稳态。

研究首先验证了星形胶质细胞缝隙连接耦合随着发育逐渐成熟。通过使用荧光黄染料（Lucifer Yellow，LY）耦合分析观察到耦合的星形胶质细胞数量随着年龄的增长而增加，从P12开始，LY扩散到数百个细胞中，从而提供了合胞体在约P12建立的初步线索（图1 a-g）。通过双膜片钳技术测量电耦合为检测缝隙连接耦合提供了更高的灵敏度。在记录的P1-3星形胶质细胞中，30%细胞未完全耦合到合胞体中。在P17-19，为5.9%。在P21-28，所有记录的星形胶质细胞均检测到电耦合（图1 h-k）。因此，LY和双膜片钳电耦合分析表明新生的星形胶质细胞从孤立个体逐渐融合为合胞体中的一员。

图1 星形胶质细胞从孤立个体逐渐融合为合胞体

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

神经胶质细胞的数量从出生时总脑细胞的6%迅速增加到成人水平的50%[6]。然而，关于神经胶质细胞数量总体增加与星形胶质细胞密度发育变化的相关性及其在星形胶质细胞合胞体空间组织中的作用知之甚少。因此，研究通过对Aldh1l1-eGFP小鼠脑切片进行组织透明化处理，对海马CA1区的GFP+星形胶质细胞合胞体空间组织进行分析。分析发现，在小鼠出生后前2周，细胞密度下降，细胞间距增加，两者均在P15达到稳定水平，明确了随着发育，星形胶质细胞合胞体空间组织分布逐渐成熟（图2a-c）。

图2 星形胶质细胞结构及合胞体组织分布在P15成熟

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

星形胶质细胞结构域的成熟是形成足够强度合胞体耦合的另一个决定因素。研究通过甲氯芬那酸（meclofenamic acid，MFA）抑制缝隙链接，然后将LY注入星形胶质细胞，对单个星形胶质细胞的形态学进行了分析。分析发现，虽然不同年龄阶段细胞突触长度的均值没有显著区别，但是突触长度的变异度在出生后早期（P3）显著大于P15，而P15的突触长度变异度与成年小鼠无显著区别。并且在P15，细胞形态逐渐形成了成熟的椭圆状细胞域。因此，形态学分析表明，小鼠海马星形胶质细胞的树状化突触结构和椭圆状细胞域在P15达到初始成熟（图2d-g）。

在研究团队既往的研究中阐述了合胞体等电位测量的基本原理[2]。若使用Na⁺电极溶液（[Na⁺]p）对单个未耦合的星形胶质细胞进行膜片钳全细胞记录，在破膜的一瞬间记录到的膜电位（V_M）约为-76 mV，定义为静息膜电位（V_M,I）。破膜后，[Na⁺]p中的Na⁺将替代内源性K⁺，会完全消除生理V_M和外向K⁺电导，最终稳态V_M（V_M,SS）会如Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) 方程预测的那样接近0 mV。而合胞体中星形胶质细胞的V_M,SS会通过缝隙连接耦合被邻近的星形胶质细胞钳制在近生理水平（-73 mV）。当合胞体耦合增强或减弱时，V_M,SS会进一步向邻近星形胶质细胞的生理V_M（即-76 mV）或 GHK预测的V_M（无耦合为0 mV) 移动（图3a）。

图3 星形胶质细胞数量与V_M,SS之间的关系

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

本研究采用上述合胞体等电位的概念来检测小鼠海马星形胶质细胞形成完全耦合的合胞体的时间。首先，研究结合LY耦合和[Na⁺]p钳制时的等电位来评估耦合星形胶质细胞数量与V_M,SS之间的关系。研究显示，在孤立的星形胶质细胞中，V_M,SS为-16.8 ± 3.3 mV。2-3个和4-6个细胞耦合时V_M,SS分别为-19.2 ± 5.0 mV和-34.0 ± 5.5 mV。7-9个细胞耦合时，V_M,SS（-60.8 ± 5.4 mV）开始接近邻近细胞的生理V_M，并与含有超过10个细胞的合胞体无显著区别（−72.5 ± 3.4 mV，p=.456），这符合先前的研究结论[2]，即至少需要7-9个耦合的星形胶质细胞才能确保记录的细胞具有与其邻近细胞相近的V_M（图3b-c）。接着，研究通过使用[Na⁺]p钳制时的V_M,SS评估了海马CA1区合胞体等电位的发育过程。P1-3星形胶质细胞的V_M,SS出现显著去极化，表明新生的星形胶质细胞缺乏足够的合胞体耦合。与P3相比，P9时的合胞体耦合显著增强，并在P12时进一步加强。P12之后，V_M,SS保持稳定。因此，成熟水平的合胞体等电位出现在P12。此外，V_M,SS的发育过程很好地拟合玻尔兹曼增长函数（R2=0.98；χ2=13.72），根据函数，合胞体等电位在小鼠出生后第13-15天达到稳定水平。综上，保守估计小鼠海马CA1区星形胶质细胞合胞体等电位达到成熟的时间为P15（图4）。

图4 小鼠海马CA1区星形胶质细胞合胞体等电位达到成熟的时间

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

合胞体等电位是由合胞体中单个星形胶质细胞K⁺电导的时空总和产生的，因此，星形胶质细胞K⁺漏通道的成熟表达对于维持此网络功能至关重要。研究分析了P1-P21星形胶质细胞的K⁺电导表型来检测K⁺漏通道表达成熟的时间。在P1，记录到的每个星形胶质细胞都具有可变整流全细胞电流电压关系（I-V），称为可变整流星形胶质细胞（VRA）[1]。VRA是功能不成熟的星形胶质细胞，具有的电压门控向外瞬时K⁺电流（IKa）和延迟整流K⁺电流（IKd）电生理表型，是与增殖细胞相关的特征[7]。随着发育，IKa和IKd电生理表型逐渐消失，VRA数量逐渐下降，从P2开始出现了以线性I-V为特征的被动星形胶质细胞（PA）[1]。PA比例逐渐增加，并在P11成为唯一的表型（图5）。被动电导是星形胶质细胞K⁺电导功能成熟的标志[8]，因此，PA是功能成熟的星形胶质细胞。PA相较于VRA，静息V_M更去极化，膜电阻更小，跨膜电流更大。且在发育过程中，PA也在进一步成熟，膜电阻减小，膜电流增大，K⁺漏电导增强，这些功能在P11-12左右达到稳定（图6）。总体而言，在P11，具有稳定静息V_M和低膜电阻的PA成为星形胶质细胞唯一表型，表明K⁺漏电导的成熟（图5-6）。

图5 在发育过程中，PA比例逐渐增加

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

图6 在发育过程中，K⁺漏电导逐渐表达成熟

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

对K⁺的缓冲调节作为星形胶质细胞的重要功能，需要合胞体内高效的K⁺空间平衡。研究使用了新设计的电生理学方法检测了合胞体这一关键功能成熟的初始时间（图7-8）。首先，研究使用[Na⁺]p钳制合胞体中的星形胶质细胞，膜片钳记录到由邻近星形胶质细胞补偿的外向K⁺电导以及细胞外人工脑脊液（aCSF，含3.5 mM K⁺）中K⁺通过K⁺漏通道流入的内向电流。然后，使用MFA阻断合胞体耦合，可记录到上述由临近细胞补偿来维持的正常外向K⁺电导显著减小（图7a-b）。接着，研究使用含0 mM K⁺的aCSF，可记录到内向K⁺电导显著减小（图7c）。进一步，在使用含有100 μM BaCl₂（内向整流通道K⁺通道抑制剂）的aCSF后，同样可以记录到内向K⁺电导显著减小，从而证实内向整流通道，包括 Kir 4.1，是介导内向K⁺漏电导的主要通道（图7d）。这组实验表明，[Na⁺]p钳制的星形胶质细胞，其外向K⁺电导是由耦合的邻近细胞提供的，并且该电流大小可用于测量合胞体对K⁺空间缓冲调节能力。

图7 合胞体耦合可以在合胞体内对K⁺高效缓冲调节

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

最后，研究回答了最初的问题，即星形胶质细胞合胞体在大脑中开始具有成熟功能的时间。使用[Na⁺]p钳制P3-P15合胞体网络中的星形胶质细胞。在P3，仅有微小的内向K ⁺电流（I_K,endogenous），这与出生后早期星形胶质细胞自身内向整流K⁺通道低密度表达一致。同时，完全没有测量到来自合胞体的外向K⁺电导（I_{K, syncytium}），归因于缺乏缝隙连接耦合。在P9，K⁺通道表达增加和合胞体部分耦合共同导致I_K,endogenous的增加，而外向K⁺电导增加主要由I_{K, syncytium}组成。在P15，功能成熟的合胞体对K⁺电导进行了充分补偿，表现为成熟星形胶质细胞的被动K⁺电导（图8a-c）。通过定量分析，I_K,endogenous和I_{K, syncytium}都随着年龄的增长而增加，并在P15达到稳定水平，与P21成年小鼠的水平无显著差异（图8d）。因此，研究证实了，在P15，小鼠海马CA1区域星形胶质细胞合胞体可以成熟地对K⁺起到合胞体内缓冲调节的作用。

图8 小鼠海马星形胶质细胞合胞体在P15达到功能成熟

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

图9 成熟星形胶质细胞合胞体的解剖和功能发育过程

（图源：Zhong, et al., Glia, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

星形胶质细胞在大脑中建立了最大的合胞体网络。本研究首次表明，在出生后的前两周内，小鼠海马新生星形胶质细胞在形态、空间组织、K⁺通道表达和细胞缝隙连接耦合方面快速发育成熟，将它们从孤立的个体转变为功能成熟的合胞体网络。一个组织和功能成熟的合胞体网络最早出现在出生后第 15 天（图9）。尽管由于无法量化合胞体耦合对内向K⁺电导的确切贡献，研究侧重从外向K⁺电导来验证合胞体缓冲调节的能力，但这一结论应该同样适用于内向K⁺电导。目前。[Na⁺]p全细胞记录以及合胞体等电位测量已被用于研究小胶质细胞-星形胶质细胞-神经元耦合的机制以及星形胶质细胞合胞体在患病条件下功能状态的变化。在未来也将有着更广泛应用，以评估各种生理和病理条件下的合胞体功能。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glia.24327

该研究受国家科技创新2030－重大项目、国家自然科学基金、国家重点研发计划项目、江苏省双创团队领军人才项目等基金支持。

第一作者钟时颖（右四），第一作者Conrad M. Kiyoshi（左二），第一作者杜一星（左三），通讯作者周民（右五）

（照片提供自：周民教授研究团队）

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本文完